熒光定量PCR（qPCR）是以熒光為基礎(chǔ)的定量分析技術(shù)，應(yīng)用非常廣泛，可以用于定量RNA的豐度（RT-qPCR），驗(yàn)證芯片或測(cè)序的數(shù)據(jù)，確定病原體的載量，進(jìn)行基因分型等等。

    熒光定量PCR儀負(fù)責(zé)監(jiān)控反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度的變化，記錄檢測(cè)熒光達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)（被稱為Ct或Cq值）。從理論上說，每一個(gè)qPCR循環(huán)會(huì)使目標(biāo)序列翻倍，因此人們可以在Ct值的基礎(chǔ)上對(duì)樣本進(jìn)行定量。

    在進(jìn)行熒光定量PCR時(shí)，我們往往會(huì)面臨眾多選擇，每一步選擇都影響著實(shí)驗(yàn)的zui終結(jié)果。好在市面上的qPCR產(chǎn)品也種類繁多，可以滿足我們的各種需求。

    染料法VS探針法熒光定量PCR主要分為染料法和探針法兩種。染料法一般采用DNA染料SYBR?Green（或Promega的BRYT?Green等），這種方法不僅使用簡(jiǎn)單，成本也zui低。不過染料法檢測(cè)的是體系中的所有雙鏈DNA，不具有序列特異性。為此，一些廠商提供ROX作為內(nèi)部熒光參考標(biāo)準(zhǔn)，用來校正背景。

    成本低是染料法qPCR的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)，DNA染料相對(duì)比較便宜，而且適用于任何序列。不過染料法無法在同一個(gè)樣本中檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)，也難以鑒定擴(kuò)增得到的序列，會(huì)受到脫靶效應(yīng)（如引物二聚體）的影響。在這種情況下，就需要進(jìn)行熔解曲線分析，判斷擴(kuò)增所得產(chǎn)物是否只有一種。