ABI 7500熒光定量PCR儀技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，zui后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

　　

　　1.Ct值的定義

　　

　　在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold（閾值，臨界值），Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

　　

　　2.熒光閾值的設(shè)定

　　

　　PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-15

　　

　　3.Ct值與起始模板的關(guān)系

　　

　　研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
 

 

　　

　　ABI 7500熒光定量PCR儀是特異性靶基因檢測(cè)與定量的一體化平臺(tái)。7500將PCR熱循環(huán)，熒光檢測(cè)和各種應(yīng)用分析軟件結(jié)合在一起，可以動(dòng)態(tài)觀察PCR每一循環(huán)各反應(yīng)管中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸增加的情況。

　　

　　定量PCR系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)模式采用25-100微升反應(yīng)體積，可以采用96孔板或單管/8聯(lián)管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)反應(yīng)。另外7500還可以升級(jí)為快速熱循環(huán)樣品基座，該升級(jí)為選購(gòu)件，由AB公司工程師負(fù)責(zé)安裝?？焖贌嵫h(huán)樣品基座采用新型96孔反應(yīng)板，這種反應(yīng)板的管內(nèi)液體上方的空間較小，可以支持5-30微升反應(yīng)體積的實(shí)驗(yàn)。采用樣品基座升級(jí)后的7500，新型96孔反應(yīng)板和新型快速熱循環(huán)定量PCR預(yù)混試劑，實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)可以在40分鐘內(nèi)完成，實(shí)驗(yàn)效果與標(biāo)準(zhǔn)2小時(shí)模式一致。

　　

　　ABI 7500熒光定量PCR儀應(yīng)用廣泛，包括基于相對(duì)定量分析的基因表達(dá)分析，以標(biāo)準(zhǔn)曲線為基礎(chǔ)的病原體定量分析，定性的PCR擴(kuò)增后核酸序列的SNP基因型分析，以及以陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照為基礎(chǔ)的陽(yáng)性/陰性結(jié)果判定。